实时荧光定量PCR仪操作规程
发布时间：2025-01-20 09:17:57 来源 : 作者： 点击：
-
- 检查实时荧光定量PCR仪主机外观是否有损坏、变形，各部件连接是否稳固。查看显示屏是否正常亮起，按键是否灵敏。
- 检查热盖是否能正常开合，温度调节功能是否正常。热盖温度需能稳定保持在合适范围，防止反应过程中样本蒸发。
- 确认仪器的光路系统清洁，无灰尘或杂物阻挡光路，以保证荧光信号的准确采集。
- 检查仪器的冷却系统，确保其正常运行，能有效散热，保证仪器在运行过程中温度稳定。
-
- 实验材料准备
- 样本：准备好经过处理的核酸样本，确保样本浓度和纯度符合实验要求。例如，对于 cDNA 样本，其 A260/A280 比值应在 1.8 - 2.0 之间，A260/A230 比值应大于 2.0。
- 试剂：准备好 PCR 反应所需的各种试剂，如荧光定量 PCR 预混液、上下游引物、探针（若使用探针法）、ROX 参比染料（根据试剂盒要求添加）等。所有试剂应在有效期内，且保存条件符合要求。
- 耗材：选择适配仪器的 PCR 反应管或 96 孔板、384 孔板。反应管或孔板应无破损、无污染，且密封性良好。同时准备好配套的管盖或板盖。
-
- 实验环境准备
- 保持实验室环境清洁、干燥，温度和湿度适宜。一般实验室温度控制在 18 - 25℃，相对湿度在 40% - 60%。
- 确保实验台面整洁，无杂物和水渍，为实验操作提供良好的条件。
- 根据实验设计，在无菌条件下，按照反应体系的要求，依次向 PCR 反应管或孔板中加入各种试剂和样本。一般先加入 PCR 预混液，再加入引物、探针（若有）、模板核酸等，最后轻轻混匀。例如，一个 20 μL 的反应体系可能包含 10 μL 的 PCR 预混液、上下游引物各 0.5 μL、探针 0.2 μL、模板核酸 2 μL，其余用无核酸酶水补足。
- 加样完成后，轻轻离心反应管或孔板，使管内或孔内液体集中在底部，避免气泡产生。离心转速一般为 3000 - 5000 rpm，离心时间 1 - 2 分钟。
-
- 放置样本
- 将加好样的 PCR 反应管或孔板放入实时荧光定量 PCR 仪的样品槽中。确保反应管或孔板放置位置正确，与仪器的检测通道对应准确。
- 如果使用反应管，需盖紧管盖；使用孔板则需密封好板盖，防止反应过程中样本挥发和污染。
-
- 程序设置
- 打开仪器操作软件，进入程序设置界面。
- 选择检测通道：根据所使用的荧光染料或探针的激发和发射波长，选择相应的检测通道。例如，FAM 荧光素一般选择 510 nm 左右的检测通道，VIC 荧光素选择 550 nm 左右的检测通道等。
- 设置反应条件：根据实验目的和所使用的 PCR 试剂盒说明书，设置 PCR 反应的温度、时间和循环数等参数。一般包括预变性步骤（如 95℃，3 - 5 分钟），然后是多个循环的变性（如 95℃，10 - 15 秒）、退火（根据引物 Tm 值确定温度，一般在 55 - 65℃，30 - 60 秒）、延伸（如 72℃，30 - 60 秒），最后可能有一个终延伸步骤（如 72℃，5 - 10 分钟）。
- 设置荧光采集参数：确定荧光信号采集的时间点和方式。一般在每个循环的退火或延伸阶段采集荧光信号，采集模式可选择自动或手动设置。
-
- 开始运行
- 确认所有参数设置无误后，点击“运行”按钮，仪器开始按照设置的程序运行。
- 在运行过程中，可通过仪器操作软件实时观察反应进展，查看荧光信号的变化曲线和各项数据。
- 严格按照仪器说明书操作，避免因操作不当损坏仪器。在仪器运行过程中，不要随意打开仪器舱门或进行其他可能干扰仪器正常运行的操作。
- 定期对仪器进行校准和维护，确保仪器的温度准确性、荧光检测灵敏度等性能指标符合要求。校准周期一般为每 6 - 12 个月一次，具体可根据仪器使用频率和厂家建议确定。
-
- 样本与试剂
- 样本和试剂的加样操作应在无菌、无核酸酶的环境中进行，防止样本污染和核酸降解。使用移液器时要注意量程的选择和操作规范，确保加样准确。
- 试剂应按照说明书要求保存和使用，避免反复冻融。已开封的试剂要注意有效期和保存条件，防止试剂变质影响实验结果。
-
- 实验安全
- 实验过程中使用的试剂可能具有一定的毒性或腐蚀性，如某些荧光染料。操作人员应佩戴好手套、护目镜等防护用品，避免试剂接触皮肤和眼睛。
- 如果在实验过程中发生试剂泄漏等情况，应及时按照实验室安全规定进行处理，防止污染环境和对人员造成伤害。
- 当仪器运行结束后，关闭仪器操作软件，打开仪器舱门。
- 小心取出 PCR 反应管或孔板，避免样本溅出。如果样本需要进一步处理或保存，应按照相关要求进行操作。
-
- 仪器清洁
- 用干净的湿布轻轻擦拭仪器内部和外部表面，去除灰尘和污渍。注意不要让水分进入仪器内部的电子元件。
- 如果有样本溅出或污染仪器，应及时使用适当的清洁剂进行清洁，然后用清水擦拭干净，再用干布擦干。
-
- 数据记录与分析
- 将实验数据从仪器中导出，保存到专用的存储设备或计算机中，并进行备份。数据应包括荧光信号强度、循环数、Ct 值（阈值循环数）等信息。
- 使用专业的数据分析软件对实验数据进行分析，如计算基因表达量、进行相对定量分析等。分析结果应进行详细记录，以便撰写实验报告和进行后续研究。
鄂公网安备42282802000109号